国产 巨乳 胃癌单细胞数据集GSE163558复现(七)：评估恶性上皮细胞增殖及迁徙智商

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Hello小伙伴们环球好，我是生信时刻树的小学徒”我才不吃蛋黄“。今天是胃癌单细胞数据集GSE163558复现系列第七期。第六期咱们证实TCGA数据库中胃癌和平日胃组织之间的各异抒发基因，界说了每个上皮细胞的恶性和非恶性评分。本期，咱们将分析恶性上皮细胞G0-G4的Marker基因并绘图热图和小提琴图，此外，咱们还将使用AddModuleScore_UCell函数运筹帷幄细胞的增殖和迁徙评分。

细胞增殖是生物体的伏击人命特征，细胞以分裂的神志进行增殖，是生物体滋长、发育、繁衍以及遗传的基础。在肿瘤多阶段演进的早期阶段，肿瘤细胞在原发灶无穷增殖。增殖智商强是肿瘤细胞恶性进程高的伏击标志之一。除了在原发灶增殖，肿瘤还不错发生转机，即肿瘤细胞在隔离其发源部位的器官中滋长，转机是多量肿瘤的最终且最致命的施展。本数据集有多个胃癌转机样本：6名患者的10个极新东谈主体组织样本，包括3个原发性肿瘤样本(PT)、1个把握非肿瘤样本(NT)和6个转机样本(M)。转机样本包括 2个肝脏转机样本(Li)、2个淋趋附转机样本(LN)、1个腹膜转机样本(P)和1个卵巢转机样本(O)。肿瘤细胞迢遥转机的历程如下：肿瘤细胞侵袭力增强；从原发部位冲突血管/淋巴管，干预轮回；从血管再次冲突干预组织定植于迢遥器官，最终在迢遥器官中增殖。在上述历程中，肿瘤细胞具有不同表型，并在肿瘤微环境中，与其周围免疫细胞和基质细胞互相作用，以复旧瘤细胞滋长，并匡助瘤细胞藏匿免疫系统的监视。为了更好的冲突组织和血管内皮，肿瘤细胞会发生上皮-间充质退换（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT），即上皮细胞向间充质细胞表型退换的历程，在EMT发生历程中，肿瘤上皮细胞向间充质细胞退换，施展为细胞花式和功能的双重改造，花式上由多边形或鹅卵石状转造成细长的纺锤状或梭形，功能上细胞极性消失、细胞骨架改造、细胞间去粘连化以及获取侵袭通顺智商等；这些表型改造会使得细胞间黏附度裁汰，迁徙通顺特色增强。使用AddModuleScore_UCell函数运筹帷幄细胞的增殖和迁徙评分，不错协助咱们评估不同恶性上皮亚群的增殖、转机后劲和恶性进程。

领先断根系统环境变量，设立责任目次，加载R包，读取恶性上皮Seurat数据:

rm(list=ls())getwd()setwd('6-TCGA_STAD/')library(tidyverse)library(tinyarray)library(data.table) library(Seurat)scRNA = readRDS('malignant.rds')

使用Seurat内置函数FindMarkers，以G1为对照，分析恶性上皮细胞各亚群（G0-4）Marker基因：

head(scRNA@meta.data)Idents(scRNA) = scRNA$celltypect = levels(scRNA@active.ident)ct1 = c("G3"， "G2"， "G4"， "G0")all_markers = lapply(ct1， function(x){  # x = ct[1]  print(x)  markers <- FindMarkers(scRNA， group.by = "celltype"，                         logfc.threshold = 0.1，                         ident.1 = x，                         ident.2 = ct[5])  #markers_sig <- subset(markers， p_val_adj < 0.1)  return(markers)})

对all_markers的list重定名，然后以“p_val_adj < 0.01”次第筛选各异抒发基因：

length(all_markers)names(all_markers) = ct1lapply(all_markers，nrow)all_markers_sig = lapply(all_markers， function(x){  markers_sig <- subset(x， p_val_adj < 0.01)})

在各异抒发基因的基础上进行富集分析，轮回绘图KEGG和GO荆棘调基因富集条形图：

plot = list()for (i in 1:length(all_markers_sig)){  deg = all_markers_sig[[i]]  deg$change = 'unknown'  deg[deg$avg_log2FC >2，]$change = 'up'  deg[deg$avg_log2FC < -2，]$change = 'down'  table(deg$change)  entrezIDs = bitr(rownames(deg)， fromType = "SYMBOL"， toType = "ENTREZID"， OrgDb= "org.Hs.eg.db"， drop = TRUE)  gene<- entrezIDs$ENTREZID  marker_new = deg[rownames(deg) %in% entrezIDs$SYMBOL，]  identical(rownames(marker_new) ， entrezIDs$SYMBOL)  p = identical(rownames(marker_new) ， entrezIDs$SYMBOL);p  if(!p) entrezIDs = entrezIDs[match(rownames(marker_new) ，entrezIDs$SYMBOL)，]  marker_new$ENTREZID = entrezIDs$ENTREZID  a = double_enrich(marker_new，n = 5)  a  plot[[i]] <- a}

plot是包含多个富集分析条形图的list，咱们不错别离索求检察，比如检察G3联系于G1(plot[[1]])各异抒发基因的GO富集分析的条形图（G3_G1$gp）：

G3_G1 = plot[[1]]G3_G1$gp

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在这里，咱们取了300个细胞，绘图了'CD63'，'CLDN4'，'EGR1'等基因的热图：

Idents(scRNA)scRNA1 = scRNAscRNA1 <-  ScaleData(scRNA1，features = rownames(scRNA1))cells = subset(scRNA1，downsample=300)##取其中的300个细胞，为了图面子rownames(cells)gene_order <- c('CD63'，'CLDN4'，'EGR1'，'SRGN'，'VIM'，'LAPTM5'，'AGR2'，'MT1C'，'S100A6'，'PLCG2'，'SAT1'，'TSPYL2')gene <- factor(gene_order， levels = unique(gene_order))cells2 <- cells[rownames(cells) %in% gene，]df <- as.data.frame(AverageExpression(object = cells2)$RNA)df <- df[gene_order， ]df = na.omit(df)pheatmap(df， cluster_rows = FALSE， cluster_cols = FALSE，         show_colnames = TRUE， scale = "row"，gaps_row = c(seq(3， 11，3))， gaps_col = c(1:4))ggsave('gene_heatmap.pdf'，width = 12，height = 8)

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数据准备：

领先索求scRNA中基因抒发矩阵raw.data：

raw.data = as.matrix(scRNA@assays$RNA$counts)raw.data[1:6，1:6]length(colnames(raw.data))

索求CD44抒发数据框data.frame

a = scRNA@assays$RNA$datarownames(a)b = as.data.frame(a['CD44'，]) colnames(b) = 'CD44'identical(rownames(b)，colnames(a))

设立raw.data列名为celltype名，将raw.data赋值为data:

colnames(raw.data) = scRNA$celltypelibrary(ggcorrplot)library(ggthemes)data = raw.datacolnames(data)table(colnames(data))

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创建数据框dat：

rownames(data)dat = data.frame(expression = b，group = colnames(data))dat = as.data.frame(dat)

将dat$group设立为因子型变量，再行设立levels律例G0-G4，str函数检察数据框dat变量，na.omit函数删除NA值，数据准备兑现后，使用ggplot绘图小提琴图：

dat$group=factor(dat$group， levels = c("G0"，"G1"，"G2"，"G3"，"G4"))str(dat$group)str(dat$CD44)dat = na.omit(dat)p = ggplot(dat = dat，mapping = aes(x = group，y = CD44)) +geom_violin(scale = "width"，adjust =1，trim = TRUE，mapping = aes(fill = group)) +  theme_few() +scale_fill_manual(values = mycolors)+  geom_jitter(width = 0.35， size = 1.1， color = "black") + # 添加点，不错调治width和size参数  theme(axis.text.x =element_text(size=20)， axis.text.y=element_text(size=20))+  labs(x=""，y="Expression Level"，title = "CD44")+  theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5)) +  theme(plot.title = element_text(size=25))+  NoLegend()p

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设定参考组，添加显赫性秀气（星号）：

library(ggpubr)p+stat_compare_means(method = "anova"， label.y = 3.5)+ # Add global p-value  stat_compare_means(label = "p.signif"， method = "t.test"， ref.group = "G0") # Pairwise comparison against reference

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我方设定对比，添加显赫性秀气（p值）：

compaired <- list( c("G0"， "G1")， c("G1"， "G2")， c("G2"， "G3") ，c("G3"， "G4"))p + stat_compare_means(comparisons=compaired，method = "t.test")

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我方设定对比，添加显赫性秀气（星号）：

p+geom_signif(comparisons = compaired，step_increase = 0.1，map_signif_level = T，test = t.test)

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CD44联系基因抒发烧图(同上):

gene_order <- c('CD44'，'PROM1' ，'LGR5'，'SOX2'，'TFRC'，'CXCR4' ，'JAG1' )gene <- factor(gene_order， levels = unique(gene_order))cells2 <- cells[rownames(cells) %in% gene，]df <- as.data.frame(AverageExpression(object = cells2)$RNA)df <- df[gene_order， ]df = na.omit(df)pheatmap(df， cluster_rows = FALSE， cluster_cols = FALSE，         show_colnames = TRUE， scale = "row")

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领先，证实原文，界说增殖和迁徙评分list：proliferation = c('MKI67'，'IGF1'，'ITGB2'，'PDGFC'，'JAG1'，'PHGDH')；migration = c('VIM'，'SNAI1'，'MMP9'，'AREG'，'ARID5B' ，'FAT1')，然后使用AddModuleScore_UCell函数运筹帷幄评分：

library(UCell)proliferation = c('MKI67'，'IGF1'，'ITGB2'，'PDGFC'，'JAG1'，'PHGDH')migration = c('VIM'，'SNAI1'，'MMP9'，'AREG'，'ARID5B' ，'FAT1')marker <- list(proliferation，migration)#将基因整成listnames(marker)[1] <- 'proliferation'names(marker)[2] <- 'migration'score <- AddModuleScore_UCell(scRNA，                              features=marker)

准备包含增殖/迁徙评分的数据框data（同上），然后绘图小提琴图：

raw.data = as.matrix(score@assays$RNA$counts)raw.data[1:6，1:6]length(colnames(raw.data))rownames(score)a = score$proliferation_UCellcolnames(raw.data) = score$celltypelibrary(ggcorrplot)library(ggthemes)data = raw.datacolnames(data)table(colnames(data))b = data.frame(expression = a，group = colnames(data))data = as.data.frame(b)dat$group=factor(dat$group， levels = c("G0"，"G1"，"G2"，"G3"，"G4"))str(data$group)str(data$expression)data = na.omit(data)p = ggplot(dat = data，mapping = aes(x = group，y = expression)) +geom_violin(scale = "width"，adjust =1，trim = TRUE，mapping = aes(fill = group)) +  theme_few() +scale_fill_manual(values = mycolors)+  geom_jitter(width = 0.35， size = 1.1， color = "black") + # 添加点，不错调治width和size参数  theme(axis.text.x =element_text(size=20)， axis.text.y=element_text(size=20))+  labs(x=""，y="Proliferation score")+  theme(plot.title = element_text(hjust = 0.5)) +  theme(plot.title = element_text(size=25))+  NoLegend()p

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我方设定对比，然后添加显赫性秀气p值：

compaired <- list( c("G0"， "G1")， c("G1"， "G2")， c("G2"， "G3") ，c("G3"， "G4"))p + stat_compare_means(comparisons=compaired，method = "t.test")

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本期，咱们分析了恶性上皮细胞G0-G4的Marker基因并绘图热图和小提琴图，并使用AddModuleScore_UCell函数运筹帷幄细胞的增殖和迁徙评分。下一期，咱们将珍重干预单细胞测序高档分析，使用monocle2进行拟时序分析（Pseudo-time analysis）。干货满满，迎接环球捏续追更，谢谢！

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